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BLI vs SPR.Duas técnicas muito utilizadas e de grande reputação.Contudo, qual será a mais vantajosa?

Patrice Boissy, Líder de Equipa em ALK-ABELLÓ – Empresa farmacêutica conta-nos a sua experiência com o Octet RED 96


PARALAB, adiante designada por PAR

Patrice, adiante designado por P.

A Paralab no passado dia 30 de novembro realizou uma visita às instalações da ALK ABELLÓ em Madrid para uma entrevista com o Dr. Patrice Boissy, líder da equipa da ALK ABELLÓ (empresa líder mundial em imunoterapia como tratamento para alergias).

PAR: ALK ABELLÓ é uma biofarmacêutica onde produzem vacinas, correto? Como é que vê o futuro nesta área?

P.: Nós produzimos um tipo especial de vacinas. Não entramos na área do que são chamadas vacinas típicas. As nossas não são preventivas, são terapêuticas.

É uma vacina no sentido em que induzimos uma reação do sistema imunitário. Submetemos os pacientes a quantidades controladas de alergénios de modo a mudar e educar o sistema imunitário. Estimulamos os linfócitos, por isso podemos falar de "vacinas", permitindo que em futuras exposições ao alergénio, a reação à sua presença seja muito menor ou inexistente (por ex. no tratamento da alergia ao veneno de Hymenoptera).


PAR: Gostaríamos de saber como tem sido a sua experiência com a técnica BLI e com o Octet RED 96.

P.: O Octet RED 96 é um equipamento do qual gosto muito. Permite-me fazer experiências em pouco tempo e ver os resultados em tempo real. Esta é uma enorme vantagem no momento de desenvolver um novo imunoensaio do tipo ELISA já que nos permite ver quais os passos que poderão ter falhado.

Com o Octet, determinamos de imediato o passo problemático uma vez que nos permite visualizar em tempo real a existência (ou não) de ligações entre moléculas bem como a sua estabilidade. …no fundo, permite-nos muita flexibilidade e agilidade no trabalho diário possibilitando desenvolver um ensaio completo em poucos dias.

PAR: Como conheceu a Fortébio?

P: Foi durante uma demonstração do Octet na sede (ALK, Dinamarca). Eles já tinham um Biacore, mas queriam substitui-lo por um equipamento mais fácil de usar e com menos manutenção.

Estávamos particularmente interessados num Octet porque na ALK ABELLÓ produzimos novos anticorpos contra alergénios a partir da técnica de Hibridoma e, por isso, necessitávamos de um instrumento para caracterizar a afinidade de cada um com os alergénios e respectivos epítopos (epitope binning). Até então, não tínhamos nenhum equipamento que fosse capaz de realizar uma triagem tão rápida.

Por esse motivo fui a Copenhaga participar numa demonstração. Em apenas 1 dia realizamos três ensaios. Em pouco tempo fomos capazes de ver todas as possibilidades que o equipamento tem.

Finalmente, após os testes, o equipamento foi enviado para cá. Estou muito feliz com ele: estive em todos os cursos "hands on" organizados pela FortéBio, o do ano passado que foi de cinética e o deste ano que foi de quantificação (novembro de 2018).

Já tinha participado anteriormente nos cursos denominados “User Meetings”, e sempre que ia sugeria que se realizasse um curso prático (o chamado “Hands-on Training”). A FortéBio acedeu e desde aí não perco um.

O Octet RED96 é um equipamento muito útil mas requer uma certa experiência, já que são equipamentos completos onde não há uma só forma de interpretar os dados; no momento da análise há muitas possibilidades, sendo por isso necessário um olho especialista treinado para isso.

PAR: Como é que reagiram os seus colegas da Dinamarca quando viram a técnica BLI frente ao SPR?

P.: Muito bem. Estão muito satisfeitos com tudo o que podem fazer com o Octet.

PAR: Já tentaram comparar resultados de BLI com os de SPR?

P.: Não, não é o nosso objetivo. Na Dinamarca fazia mais investigação, pesquisava novos anticorpos e a suas afinidades com alergénios. Fazia também trabalhos de deteção de imunoglobulinas humanas no soro que, apesar de presentes em concentrações muito baixas, eram facilmente detetáveis.

PAR: Então o vosso objetivo aqui em ALK ABELLÓ é a produção de anticorpos contra determinados alergénios? P.: Neste momento, estou mais na área de desenvolvimento (produção de reativos críticos), não tanto na área de investigação como já estive. Dedico-me principalmente à produção de anticorpos monoclonais a partir de cultivo de hibridomas. A caracterização desses anticorpos já foi feita anteriormente e, portanto, agora o Octet serve para medir de forma rápida e precisa as concentrações dos anticorpos sobrenadantes do cultivo.

A finalidade de produzir novos anticorpos é usá-los como moléculas de captura em ensaios tipo ELISA para medir e controlar a concentração de alergénios dos extratos naturais que usamos para os novos produtos.

Para nós é muito importante a quantificação pois devemos controlar a concentração de alergénios que damos ao paciente. Pode ser muito perigoso dar a um paciente sensível uma quantidade muito alta de alergénios. Poderia provocar uma reação alérgica severa.

À parte da quantificação de anticorpo, também usamos o Octet para otimizar os nossos métodos de purificação (cromatografia) uma vez que nos permite estudar em direto e a uma escala pequena a união entre duas moléculas na presença de diferentes tampões de incubação. Deste modo, podemos definir os tampões que favorecem a estabilidade do complexo e, pelo contrário, permitem uma maior dissociação. Estes são parâmetros importantes na melhoria do rendimento de uma purificação.

PAR: Como é que realizam a seleção de hibridomas?

P.: A clonagem é realizada numa placa de ELISA. Com o Octet podemos medir a interação direta com os anticorpos no sobrenadante da cultura, no entanto, temos que ter em conta as gamas de concentração de trabalho. Quando estamos perante um hibridoma que produz uma concentração abaixo de 1µg/ml, encontramo-nos bastante perto do limite de deteção. Nesses casos precisamos de realizar uma amplificação de sinal com outro anticorpo, ou com um anticorpo conjugado com peroxidase de modo a poder usar um substrato (DAB) – insolúvel e que potencia o sinal da biocamada existente no sensor. Ainda assim, a principal vantagem é a grande flexibilidade que o equipamento nos permite ter. Se o ligando está em solução a uma concentração de 1µg/ml, o equipamento é capaz de detetar a sua interação sem amplificar. Se a concentração for inferior, adicionamos as tais camadas, o que nos permite descer ao nível do nanograma, ou até menos. Como já disse anteriormente, é muito versátil.

PAR: Usa o Octet todos os dias, uma vez por semana…

P.: Depende um pouco da fase do estudo em que nos encontramos. Geralmente são feitas coleções semanais dos sobrenadantes de cultivo e análises a cada 4 semanas para não analisarmos apenas uma única amostra. A vantagem de termos o Octet, por exemplo, é que a regeneração do biossensor da Proteína G é muito fácil. Com glicina conseguimos retirar o anticorpo ligado e manter a atividade da proteína intacta.

PAR: Tem alguma ideia da quantidade de vezes que se pode regenerar um biossensor?

P.: Já o fiz 10 vezes, embora não seja possível com qualquer sensor…

A FortéBio propõe uma série de protocolos, soluções de regeneração e até um protocolo no qual são comparados 10 tipos de buffers de regeneração, fazendo 10 ciclos e, dessa forma, podem ser vistos e comparados no momento. A vantagem de termos o Octet RED96 com 8 canais é que este permite que se veja no momento e ao mesmo tempo qual é o melhor protocolo de regeneração. Após recuperação do sensor, removendo todo o ligando, podemos de seguida confirmar a preservação do sinal original.

PAR: E relativamente à manutenção?

P.: Pois, na verdade é muito pouca. Temos um contrato de manutenção porque precisamos de ter um controlo exaustivo dos equipamentos, uma vez que nos dedicamos à produção de reativos críticos e devemos assegurar que o que estamos a analisar está bem medido.

A FortéBio (equipa técnica) vem cá uma vez por ano e em menos de 1 dia o equipamento fica qualificado e pronto a usar.

PAR: Relativamente ao software, considera que é “user-friendly”?

P.: Sim, é muito fácil de usar e programar. Intuitivo.

PAR: Aqui na ALK ABELLÓ, acha que têm necessidade de um software que seja GMP compliant?

P.: De momento o Octet que usamos não está em ambiente GMP mas penso que seria interessante disporem dessa possibilidade.

PAR: Já tiveram, até agora, algum inconveniente no vosso trabalho com o Octet?

P.: O único problema que temos tido até agora é a evaporação. Tivemos um projeto com um anticorpo produzido por nós que quisemos comparar com um lote anterior. É um anticorpo muito estável, por isso a dissociação é muito difícil e temos de o deixar mais tempo em ensaio (podem ser várias horas).

O nosso equipamento não dispõe de cobertura anti evaporação mas sei que esse problema já foi resolvido com o novo Octet RED96e.


A equipa da Paralab Bio agradece a amabilidade do Dr. Boissy por nos abrir as portas do seu laboratorio e nos mostrar o seu trabalho com o Octet RED 96. Foi muito interessante conhecer a sua experiência e satisfação com o nosso equipamento.